Родилась 1 июля 1961 в Сандрингеме, Норфолк в семье Джона Спенсера. Её отец являлся виконтом Элторпа, представителем ветви того же семейства Спенсер-Черчиллей, что и герцог Мальборо, и Уинстон Черчилль. Предки Дианы по отцовской линии были носителями королевской крови через незаконнорождённых сыновей короля Карла II и незаконнорождённую дочь его брата и преемника, короля Якова II. Графы Спенсеры издавна проживали в самом центре Лондона, в Спенсер-хаузе.
Детство Диана провела в Сандрингеме, там же получила начальное домашнее образование. Её учительницей стала гувернантка Гертруда Аллен, которая учила ещё мать Дианы. Образование продолжила в Силфилде, в частной школе около Кингс-Лини, затем в подготовительной школе Ридлсуорт-Холл.